1  前言

    1.1 课题提出的研究意义 

我们经常说的B族维生素有12种以上，主要的有9种，包括维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12等，B族维生素都是辅助性的酶，帮助人体内的代谢，并且需要B族维生素之间彼此的配合作用，所以称作一个族。B族维生素是维生素里面的非常重要的一类，在缺乏B族维生素时人体会产生多种疾病，但由于我们人体又不能合成这些物质，比如可以通过喝功能饮料^[1]等补充B族维生素。B族维生素主要存在于动物的肝脏和米糠等食物中，是食物释放能量重要所在。所以对于维护人体健康、治疗很多疾病都有着非常重要的作用。所以近几年大家对于B族维生素的研究日益增加，比如B族维生素的分析检测就是其中之一。

    1.2 B族维生素荧光分析法的研究现状

1.2.1 B族维生素测定的主要方法   

经过统计，截止到目前测定B族维生素的主要方法有光度法^[2]、高效液相色谱法^[3·4]和荧光法^[5]等。光度法是通过检测被测物质在一定波长处或某一定波长范围里面的吸光度或发光强度，然后对此物质进行定量以及定性分析的方法。高效液相色谱法又叫“高压液相色谱”，“高速液相色谱”，“高分离度液相色谱”，“近代柱色谱”等。高效液相色谱属于色谱柱的非常重要的一个分支，选择液相设置为流动相，选择高压输液系统，把有不同极性的单一溶剂或者不同混合溶剂，缓冲液等流动相放到固定相的色谱柱，柱子里面各成分被分离，然后在装入检测器进行分析测定，最终实现对试样分析。目前这种方法成为化学，医学以及法检等学科中应用较多的分离分析技术。

1.2.2 B族维生素的目前研究成果

刘红英^[6]为探究分析多种B族维生素采用了高效液相色谱法，把药品以甲醇-水-磷酸（体积比设置成100:400:0.5）并且混和均匀，经过超声波提取的方法，然后用非梯度洗脱，最终完成对B族维生素的分析测定。王小如^[7]等用0.02mol/L硼酸盐的缓冲溶液，探究复合维生素B片里面维生素B1以及维生素B2，结果表明它们的分离效果非常好，各成分间达到基线分离的要求，分析周期比较短，同时样品的前处理非常简单。邓光辉^[8]等用了毛细管电泳法分离测定维生素B4含量，试验用40mmol/Ltris-4mmol/L磷酸（pH设置为8.0）缓冲溶液里面加入了0.3mmol/L的溴化十六烷基三甲基胺，分离电压设置成15kv，最终测定组分出现非常好分离效果。关世海^[9]等在维生素B12分析检测方法改进试验里面，流动相设定是3%正磷酸水溶液和乙腈的比例等于260:700，流速设置为1.7ml/min，结果表明：这种方法操作简单，准确度相当高，实用性超强，适合于维生素B12的分析测定。

1.2.3同步荧光法参与的B族维生素研究现状

除此之外目前被广泛使用的分析研究B族维生素的方法是同步荧光分析法。同步荧光分析法在七十年代初由Lloyd第一个提出的新型荧光分析技术，它与普通的荧光分析测定方法最大的区别是它同时扫描激发和发射两个单色器波长。再将测得的荧光强度信号与对应的激发波长（或发射波长） 做成光谱图，称为同步荧光光谱^[10]。同步荧光分析检测法按光谱扫描方式的不同可以被分为恒定（固定） 波长法、恒定能量法等。与普通的荧光法比较，同步荧光法测定可以使光谱简 化、减小光谱的重叠的优点以及减小散射光的干扰等独特的优点^[11]。在最近几年的时间里，同步荧光技术得到非常快速的发展，同步荧光技术的灵敏度高、样品用量少、选择性超级强、方法操作简便等优点，并且同步荧光技术荧光光谱技术还有分析时间比较短、样品预处理很少、没有破坏性、没有污染和成本低等优点，同时在医药、 临床领域、法医学界、环保领域、生命科学等领域中发挥了很大的应用价值。同步荧光分析检测法在生产生活的应用非常多，例如徐烨^[12]等研究检测了功能饮料里面的维生素B2以及B6，由此得到了相对最佳的实验条件：波长差选为70nm，扫描速度设置150nm/min，此时是低速的扫描，入射和出射狭缝宽度都等于10nm,测定波长此时B2是448nm，B6是323nm，标准曲线在0.01-0.15μg/ml时的线性良好，维生素B2和B6的平均回收率都是为98.3%-100.0%。蒋淑艳^[13]研究了同步荧光法同时分析测定药物中的维生素B1、B2和B6，采用系数校正的办法去掉维生素B1对于B6的干扰影响，同时引入表面活性剂OP(辛基酚聚氧乙烯醚)用于提高分析检测的灵敏度以及准确性。适用维生素B的检测，结果表明准确和精密度良好。结果表明当Δλ设置在65nm，维生素B1，B2和B6它们的同步荧光光谱值最大同时谱带宽度较窄，由此可知三者良好分离，灵敏度高的同步荧光峰，在这个条件下再用系数校正法对维生素B同步荧光光谱值进行校正。刘军鸽^[14]等在用同步荧光法同时测定维生素B1和B2的实验中，因为维生素B1和B2同时存在时的发射光谱里面的发射峰有彼此相互重叠的现象，进而不可以选择定量分析，如果用两套非直线校正曲线用于定量分析，工作量会很大。将荧光仪设置在同步扫描的状态，在起始波长设置在320nm，Δλ设置在70nm，维生素B1以及维生素B2的同步荧光峰会出现明显分开的情况，此时峰形比较窄，Δλ较小时，两峰重叠程度特别小，同时灵敏度呈现急剧下降的趋势。当Δλ选在70nm，维生素B1以及维生素B2的同步荧光信号相比于它们的含量出现非常好的线性关系，有助于维生素B1和B2同时分析检测。因而，对于B族维生素的研究分析又取得了较大的进展，

本课题采用固定波长差扫描技术，运用同步荧光法对B族维生素的荧光行为进行分析，摸索最佳波长差、试剂加入量、酸度、放置时间等实验条件，完成对大豆中B族维生素的分析测定，为相关研究提供参考。

2　实验部分

2.1实验仪器

WK-600A高速药物粉碎机（山东青州市精诚机械有限公司）；

FA-2004B电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；

日立F-7000型荧光分光光度计（日本日立公司）；

酸度计pHS-3C（上海精密科技仪器有限公司）；

2.2实验试剂

维生素B标准溶液：分别称取质量为的0.004g的维生素B1、B2和B6，用0.01mol/L的盐酸溶解于烧杯中，最后定容250ml的容量瓶中，配制成浓度分别为25mg/L的维生素B标准溶液，避光保存。

磷酸盐缓冲溶液：分别称取35.61g磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·2H₂O）和27.60g磷酸二氢盐（NaH₂PO₄·H₂O）配成0.2mol/L的 Na₂HPO₄和NaH₂PO₄溶液，使用时按照比例混合成不同pH值的缓冲溶液。

氯化十六烷基吡啶：称取质量为0.02033g的CPC于烧杯中，后定容至0.5L，即可配得浓度为0.15m mol/L的溶液待用。

十二烷基苯磺酸钠：称取质量为0.01846g的十二烷基苯磺酸钠，后定容至0.5L,配成浓度为0.15mmol/L的溶液待用。

十二烷基硫酸钠：称取质量为0.01662g的十二烷基硫酸钠于烧杯中，后定容至0.5L,即可配得浓度为0.15m mol/L的溶液待用。

铁氰化钾溶液：配制质量分数为1%的铁氰化钾溶液。

氢氧化钠溶液：配制质量分数为15%的氢氧化钠溶液。