2.1研究对象

我们采用了系统性硬皮病病人10人,诊断均符合最新的系统性硬皮病分类诊断标准，根据ACR/EULAR的作为纳入我们实验的系统性硬皮病病人，病人ACR/EULAR总分值均>9分，（评出的最高分值可能是19分，如果病人分值≥9分就认为是硬皮病患者）。所有纳入研究系统性硬皮病病人三个月内没有临床上用糖皮质激素和抑制免疫类药物。所有纳入研究的系统性硬皮病病人都签了书面的同意书。详细资见表2-1.

表2-1  SSc患者一般资料

病人     性别/年龄   ACR/EULAR评分^a        用药^b

1          F/ 61            12                 none

2          F/ 51            11                 none

3          M/59            12                 none

4          F/ 41            14                 none

5          F/ 44            12                 none

6          M/53            18                 none

7          F/ 54            11                 none

8          M/52            14                 none

9          F/ 42            18                 none

10         M/59            16                 none

a根据ACR/EULAR评分标准

b 标本收集前三个月内所有纳入研究系统性硬皮病病人三个月内没有临床上用糖皮质激素和抑制免疫类药物。

2.2仪器设备与试剂

2.2.1主要实验仪器

磁分离架 德国Mikenyi公司 流式细胞仪 美国Becton ickinson公司 移液器 德国Eppendorf公司 CO2 培养箱Forma cientific公司 -80℃超低温冰箱 日本三洋公司 -20℃超低温冰箱 日本三洋公司 荧光倒置显微镜 日本Nikon公司 荧光定量PCR otor-Gene3000A 澳洲Corbett公司 BioTekElx800自动酶标仪 美国基因有限公司 各式电泳仪 美国Bio-Rad公司 FM100制冰机 美国GRANT公司 高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司 台式离心机 德国Eppendorf公司 电子天平 美国Fisher cientific公司 层析冰柜 美国Fisher cientific公司 水平电泳槽 美国Bio-Rad公司 制冷循环水浴箱 美国Thermo lectron公司 超纯水系统 美国Millipore公司 凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司

 

 

2.2.2主要试剂及耗材

 

MACS CD4磁珠 德国Miltenyi公司 PBS 长沙瑞晶生物公司 BSA 美国Amresco公司 DMSO 捷瑞生物工程有限公司 RA 美国sigma公司 IL-2 美国peprotech公司 TGF-β 美国peprotech公司 DynabeadsHuman -ActivatorCD3/CD28 美国Life,公司 RPMI1640 美国Gibco公司 CD4-FITC流式抗体 美国BD公司 CD25-APC流式抗体 美国BD公司 FOXP3-PE流式抗体 美国BD公司 FOXP3 BufferSet 美国BD公司 LS分离柱 德国Miltenyi公司 6孔板 美国Axygen公司 0.1~0ul吸头 美国Axygen公司 10-100ul吸头 美国Axygen公司 100~1000ul吸头 美国Axygen公司 EP管 美国Axygen公司 1.5ml离心管 美国Axygen公司 15 ml、50ml离心管 美国Falcon公司 PrimeScript^TM RTwithgDNA 日本Takara公司 SYBRPremixExTaq^TMreal-timePCR 日本Takara公司 兔抗人Foxp3抗体 Cellsignaling公司 抗β-actin抗体 SantaCruZ生物工程公司 PVDF膜 瑞典Amersham公司 12孔板 美国Axygen公司 过滤器 美国Millipore公司 连接酶 美国NEB公司 DNA回收试剂盒 美国promega公司 pGEM-T andpGEM-TEasyVector 美国Promega公司 蛋白胨 美国Amresco公司 酵母提取物 美国Amresco公司 琼脂粉 美国Sigma公司 氨节青霉素 美国Sigma公司 X-gal 美国Promega公司 IPTG 美国Promega公司 大肠杆菌DH5a 本实验室保存 胎牛血清 美国Gibco公司

 

2.3试剂配制

（1）PBS:

（2）过柱时用的缓冲液Buffer：

（3）药物配制方法: 全反式维甲酸为脂溶性白色粉末，100mg溶于3.33ml二甲基亚砜DMSO中配成母液浓度为30mg/ml(0.1M), 使用时用根据实验设计稀释至终浓度。

Western blotting 所用溶液：

（1）清洗WB膜时用的清洗液TBST buffer：称下列东西放入1L杯中：Nacl 为8.8g 1M Tris-HCl 为(pH8.8) 20ml 加入800ml水，充分搅拌；加入0.5ml 的Tween20后充分混合；加水定容至1L, 4℃存储。

（2）蛋白电泳时所用的缓冲液1000ml:称下面这些试剂放到1L杯中：Tris 为15.1g 甘氨酸需要94g SDS 5.0g加入800ml水，充分搅拌溶解；加去水定容到1L，室温存储。

（3）膜转移液1L:称下面一些试剂放入1L杯中；

（4）WB时封闭膜用的缓冲液100ml：称5g脱脂奶粉放入到0.1L的TBST Buffer里面去。4℃存储。