1研究背景

苯(benzene)是当前工业生产中重要的化工原料，知网论文查重从石油、煤焦油的提炼过程中获得，可作为生产原料和有机溶剂、稀释剂，在制胶粘胶、造漆喷漆、制鞋、印刷等行业应用广泛。在现代工业的发展过程中，职业环境苯暴露及苯中毒已经成为人们关注的职业健康问题。

国际癌症研究机构（IARC）于1982年正式将苯确定为人类一类致癌物和白血病致病因子，许多国家的职业卫生机构如职业安全和卫生管理署等也把苯列为人类致癌物。我国在1987年把苯致白血病确定为职业性肿瘤，并把苯相关白血病在1997年修订的GB3230-1997《职业性苯中毒诊断标准及处理原则》中列入诊断标准。近年来职业环境苯暴露受到广泛关注，我国2002年修订的苯职业接触限值将短时间接触阈限值容许浓度（PC-STEL）降低为10mg/m³，时间加权平均容许浓度（PC-TWA）降低为6mg/m³，但是目前关于苯接触阈限值（3.25mg/m³）是否安全仍有争议。虽然我国一再降低苯的职业接触限值，但是苯中毒依然在引起职业中毒的化学物质中居前三位。据卫计委发布的2014年全国职业病报告情况数据显示，苯引起的职业慢性中毒在各类化学物质中居于首位（282例，占总慢性职业中毒人数的35.47%），各类慢性职业中毒死亡2例，均为苯中毒。苯所致白血病在职业性肿瘤中同样居于首位(53例，占总职业性肿瘤人数的44.53%)。^[1]

知网论文查重

近年来我国苯产量和消费量处于逐年增长状态，2010年苯产量超过五百万吨，在职业环境中有苯接触的工人超过五十万。苯对人体的毒性主要表现为神经系统毒性和造血系统毒性，急性毒性主要引起神经系统损伤，出现失眠多梦、食欲减退、记忆力下降、头晕乏力、牙龈鼻腔出血等症状^[2],慢性苯中毒主要引起血液系统症状如外周血白细胞计数下降、再生障碍性贫血、骨髓增生不良综合征，甚至会引起急性髓性白血病、慢性淋巴性白血病等各种类型白血病^[3]。慢性苯中毒患者通常会出现外周血细胞数量下降，且部分患者在停止接触苯一段时间后外周血白细胞计数仍持续低于正常值（4×10⁹/L）^[4]。外周血白细胞计数下降是苯接触的敏感指标，然而有关于苯接触工人的研究发现，外周血细胞微核率在白细胞尚处于正常范围时已经出现上升的现象^[5]，工人接触苯浓度为10mg/m³时已经产生染色体损伤，因此淋巴细胞微核率检测是检测慢性苯中毒的更敏感指标。外周血淋巴细胞微核率是反映机体遗传物质损伤的生物标志物，可用于监测苯接触工人的染色体畸变和早期遗传损伤水平，有利于筛检出已产生遗传损害的无症状高危人群，为保护职业健康、制定生物监测标准提供理论依据。^[6]

2 对象与方法

2.1对象

2.1.1对象 本实验病例组为上海市肺科医院29名已确诊的轻度苯中毒患者，既往无血液系统疾病、肾功能衰竭、糖尿病、结核等重大疾病，其中男性11名，女性18名；对照组为上海某造漆厂职工53名，非从事接触苯及其他毒物的工作岗位，且无长期服药史，其中男性34名，女性19名。经调查对象知情同意后，如实、完整填写调查问卷并自愿抽取外周静脉血。

2.1.2主要试剂及仪器 RPMI1640培养基 （Gibico）、双抗 (Hyclone)、胎牛血清 (Gibico)、CO2恒温培养箱 (Thermo Fisher)、离心机  (Thermo Fisher)、六孔板、15ml离心管（Corning），细胞松弛素B（Sigma）、甲醇（分析纯）、冰醋酸（分析纯）、氯化钾（分析纯）、Giemsa染液（Sigma）、载玻片、重铬酸钾、浓硫酸。

2.2方法

2.2.1 血常规检测 病例组血常规采用上海市肺科医院血常规检测结果；对照组血常规检测结果由上海市劳动卫生职业病防治研究所提供。

2.2.2微核试验 采用人外周血淋巴细胞胞质分裂阻断法微核试验（全血法），0.5ml新鲜肝素抗凝全血，加入5ml培养瓶中，混匀后37℃，5%CO₂培养箱培养44h；加入200μl细胞松弛素-B应用液，摇匀后继续培养至72h。培养结束后吸弃大部分上清液，转移入15ml离心管中，800-1000r/min离心10min后弃去上清，加3ml低渗液混匀，37℃水浴5min，立即加入3ml固定液混匀，800-1000r/min离心10min，吸弃上清，沿管壁缓缓加入4ml固定液混匀，800-1000r/min离心10min，吸弃上清，再次加入4ml固定液混匀，800-1000r/min离心10min后弃上清，加入20μl新鲜固定液，滴片并自然干燥，使用10%Giemsa染液染色13分钟。

2.2.3镜检 严格遵循盲法阅片原则，利用10×100油镜，低倍镜下找到有细胞的视野，转至高倍镜观察，计数1000个细胞膜完整、细胞核边界清晰的双核细胞，并计数出现微核的双核细胞数。微核判定标准：细胞完整、边界清晰，微核多为圆形或椭圆形，直径为主核的1/16-1/3，且与主核不连接、不重叠，微核不能折光，染色与主核一致，可以比主核略深或略浅。无论细胞中含有几个微核，均按1个微核细胞计数。每个观察单位均观察2张片子，算出平均双核微核率（‰）。

2.2.4 问卷调查 对病例组的问卷调查包括一般情况、工作情况、个人习惯、家族史、既往病史、临床症状等，对照组的问卷内容包括一般情况、吸烟饮酒情况、既往史和家族史。

2.3统计学分析

使用Excel建立数据库，采用SPSS19.0软件进行统计分析，运用t检验、卡方检验、U检验、logistic回归分析进行相关数据的统计分析。病例组与对照组间白细胞指标为连续性变量，采用t检验；两组性别为二项分布，采用卡方检验；由于微核指标为离散型变量，故采用U检验；分析相关因素对微核率影响时，将微核率转换为微核是否异常（微核率正常界值为4‰），运用logistic回归分析进行相关性分析。检验水准α=0.05，即P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 一般情况

病例组平均年龄为（52.9±12.7）岁，对照组平均年龄为（47.2±9.0）岁，经t检验，差异有统计学意义（P=0.019<0.05）；病例组共29人，女性占62.07%，对照组53人，女性占35.85%，经卡方检验，两组性别组成差异有统计学意义（P=0.02<0.05）。

3.2 病例组与对照组微核率比较

病例组的淋巴细胞微核率为（6.55±2.91）‰，微核率范围为2-12‰，对照组淋巴细胞微核率为（3.91±1.62）‰，微核率范围为1-8‰，对两组微核率进行U检验，见表1，两组微核率差异有统计学意义（P<0.05），说明病例组微核率水平整体高于对照组。

表1：病例组与对照组微核率比较

  检查人数 微核率范围（‰） 微核率异常率（%） U P 病例组 29 2-12 69.00 4.110 <0.01 对照组 53 1-8 33.96

 

3.3 病例组与对照组白细胞计数比较

病例组白细胞计数为（3.75±0.47）×10⁹/L,计数范围为3.1-4.8×10⁹/L,对照组白细胞计数为（6.34±1.64）×10⁹/L，计数范围为4-14×10⁹/L，对两组白细胞计数进行t检验，见表2，两组白细胞计数差异有统计学意义（P<0.05），提示病例组白细胞计数整体偏低。血常规检测白细胞计数低于4.5×10⁹/L为白细胞降低，即白细胞异常，由统计结果可发现病例组白细胞异常率远高于对照组。

 

表2：病例组与对照组白细胞计数比较

  人数 WBC异常率（%） 均值 标准差 P t 病例组 29 96.55 3.746 0.468 <0.01 6.591 对照组 53 9.43 6.339 1.637

3.4 病例组微核异常率影响因素分析

对微核率可能产生影响的因素有性别、年龄、接苯工龄、个人卫生习惯、吸烟饮酒状况等。由于微核率服从poisson分布，将微核率按照0-4‰为正常值的标准转化为微核率正常与异常的二分类变量，利用二元logistic回归模型以微核率是否正常为因变量，分析微核率的相关影响因素，最后进入方程的变量为性别、年龄、接苯工龄，见表3。根据分析结果，性别和年龄对微核异常率影响的差异无统计学意义，接苯工龄对微核异常率影响的差异有统计学意义，且接苯工龄为微核异常率的具有保护性。

表3：微核异常率影响因素logistic回归分析

因素 β 标准误 walds P值 OR值 95%CI 下限 上限 性别 0.077 1.071 0.005 0.943 1.080 0.132 8.817 年龄 0.067 0.048 1.954 0.162 1.070 0.973 1.175 接苯工龄 -0.183 0.090 4.143 0.042 0.833 0.698 0.993

3.5 病例组神经系统及血液系统临床症状比较

本实验针对病例组的调查中涉及了苯对神经系统和血液系统毒性作用可能产生的症状，问卷中关于临床症状发生的频率分为三类：无、有时、经常。表4统计了各种症状发生频数，将“有时”和“经常”均视为有类似症状发生，记为“有”；“无”即为无类似症状发生，记为“无”。其中失眠多梦、注意力不集中、记忆力减退、乏力、头晕等神经系统症状发生率均在65%以上，而血液系统症状中除了有牙龈出血的病例占全部病例的68.97%，其中鼻腔出血和皮下瘀斑分别为20.69%和41.38%，相比其他症状出现频率较低。经卡方检验，微核率是否异常与是否出现临床症状差异无统计学意义（P>0.05）。

表4：病例组临床症状频数表

  失眠多梦 注意力不集中 记忆力减退 乏力 头晕 牙龈出血 鼻腔出血 皮下瘀斑 无 8 10 10 7 7 9 23 17 有 21 19 19 22 22 20 6 12

3.6 病例组苯接触相关行为习惯比较

本实验病例组问卷中设计了苯接触相关的个人习惯调查，将各项行为的发生频率分为三个等级：无、偶尔（1-2次/周）、经常（3次及以上/周），频数统计见表5，其中“无”表示从来没有这种行为，“偶尔”和“经常”均记为“有”，由于部分问卷存在缺失项，故无法进行完全统计。使用护具的病例占病例总数的37.93%，下班后洗澡的病例占病例总数的51.72%，在车间吸烟和吃东西的分别占6.90%和24.14%，上下班换工作服的的病例占病例总数的86.21%。经卡方检验，是否有下列各种行为与微核率是否异常差异无统计学意义（P<0.05）。

表5：病例组行为习惯频数表

  护具使用情况 下班后洗澡 在车间吸烟 在车间吃东西 上下班换工作服 无 12 12 26 21 3 有 11 15 2 7 25 缺失 6 2 1 1 1

4 讨论

微核是由于染色体分裂时受到外源理化因素干扰导致染色体损伤而形成的类核小体，是染色体畸变的表现形式，外周血淋巴细胞微核率检测广泛用于测试及评价化学物质等对遗传物质的损伤。苯是全球公认的致癌化学毒物，可对人体造成基因水平的损害。我国职业性苯中毒的诊断标准主要参考血象指标及出血倾向^[7]，微核率作为在白细胞计数出现异常之前产生改变的苯接触生物指标，可为苯暴露工人提供遗传损伤检测和工作环境有害因素的监测，在早期职业健康防护方面有积极预防和及时发现的作用。

近年来，随着国家和企业对职业环境安全的重视程度增加，苯的职业接触限制一再降低，企业和工人对于职业健康防护意识增强，作业过程中的急性苯中毒事件已很少发生，但是慢性苯中毒仍对工人健康造成极大危害。职业环境中苯主要以苯蒸汽状态通过呼吸道、皮肤侵入人体，造成慢性苯中毒。现有多项研究显示，长期低剂量接苯作业工人白细胞异常率和微核异常率均显著高于对照组^[8-11]，与本实验所得结论一致。Science期刊于2004年刊登文章指出，在低剂量苯（1ppm）工作环境下作业的工人也表现出造血系统的损害^[12]，但是目前仍有部分研究认为低浓度苯暴露不会对血液系统产生损伤^[13-14]。

本研究选取上海市肺科医院已确诊为轻度苯中毒的患者为病例组，上海某造漆厂非从事苯接触工作的员工作为对照，分析苯以及苯暴露程度相关的部分因素对微核率的影响。分析结果显示，病例组与对照组的微核率和白细胞计数均有显著的差异，病例组白细胞计数显著低于对照组，微核率及微核异常率明显高于对照组，说明苯接触对人体可造成遗传损伤和血液系统的损害，验证了现有研究中的结论。由于研究对象中吸烟和饮酒比例较低不足以具有代表性，故没有进行吸烟和饮酒状况对微核率影响的比较分析。在苯暴露程度相关因素与微核率的分析中，年龄和性别与微核率异常并无相关性或相关程度较低，可能与本实验选取病例的年龄与性别组成有关。在其他研究中显示一般人群中性别和年龄均会对微核率产生影响^[15]，微核自发率与年龄呈正相关，且女性尤其是40岁以上女性微核自发率明显高于男性^[16]。本研究病例组年龄平均为（52.9±12.7）岁，女性比例为62.07%，整体年龄偏大且女性较多，排除苯的影响，本身微核自发率偏高，有可能对实验结果产生影响。

实验数据分析结果显示接苯工龄与微核率呈负相关，而现有的关于接苯工龄与微核率的文献报道多数给出的结论为接苯工龄与微核率呈正相关关系^[8,17-18]，这与本次实验结果是相反的。造成这种情况可能的原因有：(1)病例组人数较少，每个病人发病情况、接受治疗情况及个人体质对微核率有不同程度的影响，个体差异较大；(2)病例不是来自同一工作环境，先前在作业过程中的苯浓度及接触方式各不相同，不能利用接苯工龄来判断病例接触苯的累积计量，所以无法单纯通过接苯工龄说明苯暴露的程度，反而会造成偏倚；(3)病例可能同时受到苯和其他理化因素的损伤，研究中没有排除相关干扰因素对微核率的影响(4)年龄较大的病例有更大的可能性被调离原先直接接触苯的工作岗位，接触苯的机会和时间减少，苯对该部分病例的影响降低。因此，虽然病例组接苯工龄与微核异常呈负相关关系，但是病例组微核率显著高于对照组，说明苯接触是微核率升高的危险因素，而病例组由于研究对象个数较少、个体接受治疗时间不同、个体作业环境苯浓度及暴露程度差异等原因，本次研究中微核检测并不是特异性的，导致研究中包含奈曼偏倚和混杂偏倚，分析结果中产生了接苯工龄与微核率呈负相关的结论，应把病例在作业现场苯接触具体情况纳入苯暴露程度中进行分析才能得到更加准确的结论。