摘 要

乳酸杆菌属于乳酸杆菌科，呈杆状的革兰氏阳性菌，因发酵糖产生大量乳酸而命名。可发酵碳水化合物并产生大量乳酸，在自然界分布广泛，是动物和人肠道等处重要的生理性菌群之一。在乳杆菌科中，乳酸杆菌是最大的一个属。乳杆菌属与动物关系最密切，它是动物和人类肠道和阴道中占优势的菌群之一。为了解MS活性糖对乳酸杆菌的生物学影响，通过MS活性糖对乳酸杆菌增殖的影响、产酸性检测、耐酸实验、耐热实验等，研究MS活性糖对乳酸杆菌生物学特性的影响。结果表明MS活性糖对乳酸杆菌的产酸量、耐酸性及耐热性均有影响。通过本试验了解MS活性糖对乳酸杆菌的影响，从而为MS活性糖的使用提供了科学依据。

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前 言

MS糖是一种制作工艺简单，价格低廉并具有广泛开发前景的新型功能性多糖，是一种能提高动物体内营养物质吸收率的辅助食品用功能液。由韩国Mexcell Bio研究所研制成功并于2013年申请专利（专利号：10-1302119）。据夏泽、江贺等人研究显示，MS糖对鸡源乳酸杆菌有增菌效果^[1]，因此进一步研究MS糖对鼠源乳酸杆菌的生物学活性影响。

乳酸菌是人体和动物体肠道中的有利菌群之一，能在生物体生长过程中提高机体免疫力，改善动物消化道环境，改善机体营养状况，还能够调节肠道微生物菌群的平衡，增强机体的免疫力和抵抗力，并能促进肠道的生长和发育。因此，乳酸菌在消化道中的存在，对动物体的生长和对疾病的免疫有重要作用。但在自然环境条件下，大部分乳酸菌的定植能力差，对外界环境的耐热性及耐酸性弱，这就限制了其发挥有效的生物学功效^[2]。

在许多食品中都含有乳酸菌，比如酸奶、泡菜。经研究表明，乳酸菌属于有益菌，能使集体生长加快，维持动物体内正常菌种的平衡，并改善肠胃功能。乳酸菌可以帮助人体减少体内的胆固醇，并控制内毒素的含量，抑制肠道内有害菌种的生长。经研究表明^[4]，乳酸菌的含量能直接影响人的健康程度，可以说，乳酸菌对于人类多多益善 ；乳酸菌制品中含有抗高血压的物质，而长期以来，乳酸菌一直存在与人类传统发酵食品中，因此，在降血压方面比药物具有更高的安全性，酸奶等乳酸发酵食品在改善机体健康方面具有潜在作用，可作为永恒的营养保健食品^[5]。

乳酸杆菌还有一定的抗衰老和防癌作用^[6]，然而在乱用抗菌素的情况下，部分人已经失去正常的肠道调节功能，造成肠道功能失调^[7]，通过使用含有乳酸杆菌的食品，例如酸奶，可以使肠道菌群尽快恢复正常。在日本，乳酸菌制品已占日本乳制品市场的80%以上，二十年来日本年轻人平均身高增加10厘米，日本人口平均寿命高达80岁，居世界第一位。这些令中国可望不可即的数据都是乳酸菌制品所带来的直接功效。

因此，为了了解MS糖对乳酸杆菌的生物学活性影响，取分离自小鼠肠道内乳酸杆菌，并进行体外培养。通过添加不同浓度梯度的MS糖，确定MS糖最适浓度，进行产酸性试验、耐酸性试验、耐热性试验等生物学试验进一步确定MS活性糖对小鼠体内乳酸杆菌的生物学活性的影响。通过这一系列试验，为MS活性糖的研发及利用提供了重要的依据。

材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1菌种来源

小鼠，鼠源乳酸杆菌，从动物体内获取

1.1.2 药品与试剂

MS糖（由韩国Mexcell Bio研究所提供）

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏（由北京奥博星生物技术有限公司购买）、乙酸钠、葡萄糖、乳糖、无水磷酸氢二钠、柠檬酸铁铵、氯化镁、硫酸锰、吐温-80等（由上海震兴试剂厂购买）。

1.1.3 仪器

高压蒸汽灭菌锅                                     上海安申医疗器械厂

电子精密天平                     梅特勒-托多利公司

YP1030型电子天平                   上海精密科学仪器公司

显微镜YS110                       北京东方德科学教育责任有限公司

超净工作台                       苏州安泰空气技术责任有限公司

U-18900分光光度计                        日本日立股份责任有限公司

恒温水浴锅H-S                                江苏恒丰仪器厂

HZQ-X130恒温振荡培养箱                    哈尔滨市南明医疗仪器厂

摇床                             哈尔滨市东联电子开发有限公司

恒温培养箱                       上海跃进医疗器械厂

4 ℃电冰箱                       澳柯玛股份责任有限公司

数码酸度计                          杭州科盛机电厂

1.2 培养基制备

1.2.1 培养基的制备

MRS培养基：用于培养及保存乳酸杆菌

改良MRS液体培养基^[3]：乙酸钠5 g、蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、乳糖5g、无水磷酸氢二钠2 g、柠檬酸铁铵2g、氯化镁0.5 g、硫酸锰0.05 g、蒸馏水1000mL。将以上各成分加热溶解于蒸馏水中，调节pH 至6.2-6.4，再加入吐温-80 1 ml，分装试管，121℃高压蒸汽灭菌15 min，冷却备用。

MRS固体培养基：在MRS液体培养基中加入琼脂15g，121℃高压蒸汽灭菌20min,待冷却至60℃左右时，倒入灭菌平板，冷却备用。

普通肉汤培养基：氯化钠、牛肉粉各0.5g,磷酸二氢钠0.1g，蛋白胨1.0g，蒸馏水100ml，PH7.2-7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却备用。

1.3 试验方法 

1.3.1 乳酸杆菌的分离

• 处死小鼠:取小鼠于试验台，用镊子压住小鼠颈部，另一只手拉住小鼠尾巴，直至小鼠断颈。
• 取肠道内容物：剖开小鼠，取一小段肠段，切开，并取其内容物。
• 将肠道内容物接种于分离培养基（MRS培养基+溴甲酚紫),37℃厌氧培养24h。

1.3.2 乳酸杆菌的鉴定及观察

分离培养基由紫色变为黄色，变黄部分为疑似乳酸杆菌，并进行后续鉴定实验。

• 糖酵解实验：用接种环移取培养基变黄部分培养物少许,接种于发酵液体培养基管中。接种后,置37℃培养,定期观察结果,观察培养基颜色有无改变（产酸）,试管中有无气泡,微小气泡亦为阳性。
• 淀粉水解实验：用接种环移取培养基变黄部分培养物少许,接种于淀粉肉汤培养基中，37℃培养24h。然后将碘试剂直接滴于试管中,立即检视结果,阳性反应为肉汤颜色无变化；阴性反应为肉汤呈深蓝色。
• 镜下观察，菌落呈乳白色，边缘整齐，表面光滑，菌落较小，革兰氏染色呈阳性，无芽孢，不运动。即可确定为乳酸杆菌。

1.3.3菌悬液的制备

将取好的乳酸杆菌接种在液体MRS培养基中，利用烛缸法在厌氧条件下，37℃恒温培养48h，得到试验用菌悬液。

1.3.4 MS糖对乳酸杆菌增殖影响及最适浓度测定

取80只试管，分成四组并分别编号为0号到19号，每个试管配置不同浓度的糖普通肉汤培养基，0号试管糖浓度为0%，1号试管为0.1%，2号试管为0.2%，直至9号试管为0.9%，10号试管浓度为1%，11号试管菊糖浓度2%，19号试管糖浓度10%。设立环境对照组。灭菌后每个试管加入100μL乳酸杆菌菌液，培养24h利用紫外分光光度计测定OD₆₀₀nm值，从而确定MS糖对乳酸杆菌的最适添加浓度范围。

1.3.5 MS糖对乳酸杆菌生长曲线的影响

取20支试管，将普通肉汤培养基分装于试管中，每管10 ml，121 ℃灭菌20 min。灭菌后，取乳酸杆菌菌悬液，接种于试管中，每管100μL。37 ℃厌氧培养，从开始培养记为0h，每2h取出一支试管，放至4 ℃冰箱保存备用，36 h后，依次测定OD₆₀₀nm值，并绘制乳酸杆菌的生长曲线。在加入糖的普通肉汤培养基中接种乳酸杆菌菌悬液，每2h取出一只试管，放入冰箱保存备用，36h测定OD值，进行对比。

1.3.6 MS糖对乳酸杆菌产酸性的影响

取42支试管，将液体普通肉汤培养基分装于试管中，每管10ml，121℃灭菌20mim。灭菌后，取乳酸杆菌菌悬液，接种于试管中，每管100μL，每组三个重复，37℃厌氧培养。每2小时取样一次，并用酸度计测量pH值，计数。

1.3.7 MS糖对乳酸杆菌耐酸性的影响

取菌液50μL接种于5%MS糖的培养基中，并设计对照组，将培养基的的pH调整到2.0和6.8，分别培养2、4、6、8h后取样，稀释，涂布在MRS培养基平板培养，37℃厌氧培养24h平板法计数，计算活菌率。

1.3.8 MS糖对乳酸杆菌耐热性的影响

取菌液50μL接种于5%MS糖的培养基中，每组3个重复，37℃培养24h后分别置于40、60、80℃水浴，处理10、20、30分钟后取样，稀释，涂布在MRS培养基平板培养，37℃厌氧培养24h平板法计数，计算活菌率。