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摘 要
乳酸杆菌属于乳酸杆菌科,呈杆状的革兰氏阳性菌,因发酵糖产生大量乳酸而命名。可发酵碳水化合物并产生大量乳酸,在自然界分布广泛,是动物和人肠道等处重要的生理性菌群之一。在乳杆菌科中,乳酸杆菌是最大的一个属。乳杆菌属与动物关系最密切,它是动物和人类肠道和阴道中占优势的菌群之一。为了解MS活性糖对乳酸杆菌的生物学影响,通过MS活性糖对乳酸杆菌增殖的影响、产酸性检测、耐酸实验、耐热实验等,研究MS活性糖对乳酸杆菌生物学特性的影响。结果表明MS活性糖对乳酸杆菌的产酸量、耐酸性及耐热性均有影响。通过本试验了解MS活性糖对乳酸杆菌的影响,从而为MS活性糖的使用提供了科学依据。
MS糖是一种制作工艺简单,价格低廉并具有广泛开发前景的新型功能性多糖,是一种能提高动物体内营养物质吸收率的辅助食品用功能液。由韩国Mexcell Bio研究所研制成功并于2013年申请专利(专利号:10-1302119)。据夏泽、江贺等人研究显示,MS糖对鸡源乳酸杆菌有增菌效果[1],因此进一步研究MS糖对鼠源乳酸杆菌的生物学活性影响。
乳酸菌是人体和动物体肠道中的有利菌群之一,能在生物体生长过程中提高机体免疫力,改善动物消化道环境,改善机体营养状况,还能够调节肠道微生物菌群的平衡,增强机体的免疫力和抵抗力,并能促进肠道的生长和发育。因此,乳酸菌在消化道中的存在,对动物体的生长和对疾病的免疫有重要作用。但在自然环境条件下,大部分乳酸菌的定植能力差,对外界环境的耐热性及耐酸性弱,这就限制了其发挥有效的生物学功效[2]。
在许多食品中都含有乳酸菌,比如酸奶、泡菜。经研究表明,乳酸菌属于有益菌,能使集体生长加快,维持动物体内正常菌种的平衡,并改善肠胃功能。乳酸菌可以帮助人体减少体内的胆固醇,并控制内毒素的含量,抑制肠道内有害菌种的生长。经研究表明[4],乳酸菌的含量能直接影响人的健康程度,可以说,乳酸菌对于人类多多益善 ;乳酸菌制品中含有抗高血压的物质,而长期以来,乳酸菌一直存在与人类传统发酵食品中,因此,在降血压方面比药物具有更高的安全性,酸奶等乳酸发酵食品在改善机体健康方面具有潜在作用,可作为永恒的营养保健食品[5]。
乳酸杆菌还有一定的抗衰老和防癌作用[6],然而在乱用抗菌素的情况下,部分人已经失去正常的肠道调节功能,造成肠道功能失调[7],通过使用含有乳酸杆菌的食品,例如酸奶,可以使肠道菌群尽快恢复正常。在日本,乳酸菌制品已占日本乳制品市场的80%以上,二十年来日本年轻人平均身高增加10厘米,日本人口平均寿命高达80岁,居世界第一位。这些令中国可望不可即的数据都是乳酸菌制品所带来的直接功效。
因此,为了了解MS糖对乳酸杆菌的生物学活性影响,取分离自小鼠肠道内乳酸杆菌,并进行体外培养。通过添加不同浓度梯度的MS糖,确定MS糖最适浓度,进行产酸性试验、耐酸性试验、耐热性试验等生物学试验进一步确定MS活性糖对小鼠体内乳酸杆菌的生物学活性的影响。通过这一系列试验,为MS活性糖的研发及利用提供了重要的依据。
MS糖(由韩国Mexcell Bio研究所提供)
蛋白胨、牛肉膏、酵母膏(由北京奥博星生物技术有限公司购买)、乙酸钠、葡萄糖、乳糖、无水磷酸氢二钠、柠檬酸铁铵、氯化镁、硫酸锰、吐温-80等(由上海震兴试剂厂购买)。
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1.2.1 培养基的制备
分离培养基由紫色变为黄色,变黄部分为疑似乳酸杆菌,并进行后续鉴定实验。
1.3.3菌悬液的制备
将取好的乳酸杆菌接种在液体MRS培养基中,利用烛缸法在厌氧条件下,37℃恒温培养48h,得到试验用菌悬液。
取80只试管,分成四组并分别编号为0号到19号,每个试管配置不同浓度的糖普通肉汤培养基,0号试管糖浓度为0%,1号试管为0.1%,2号试管为0.2%,直至9号试管为0.9%,10号试管浓度为1%,11号试管菊糖浓度2%,19号试管糖浓度10%。设立环境对照组。灭菌后每个试管加入100μL乳酸杆菌菌液,培养24h利用紫外分光光度计测定OD600nm值,从而确定MS糖对乳酸杆菌的最适添加浓度范围。
取20支试管,将普通肉汤培养基分装于试管中,每管10 ml,121 ℃灭菌20 min。灭菌后,取乳酸杆菌菌悬液,接种于试管中,每管100μL。37 ℃厌氧培养,从开始培养记为0h,每2h取出一支试管,放至4 ℃冰箱保存备用,36 h后,依次测定OD600nm值,并绘制乳酸杆菌的生长曲线。在加入糖的普通肉汤培养基中接种乳酸杆菌菌悬液,每2h取出一只试管,放入冰箱保存备用,36h测定OD值,进行对比。
取42支试管,将液体普通肉汤培养基分装于试管中,每管10ml,121℃灭菌20mim。灭菌后,取乳酸杆菌菌悬液,接种于试管中,每管100μL,每组三个重复,37℃厌氧培养。每2小时取样一次,并用酸度计测量pH值,计数。
取菌液50μL接种于5%MS糖的培养基中,并设计对照组,将培养基的的pH调整到2.0和6.8,分别培养2、4、6、8h后取样,稀释,涂布在MRS培养基平板培养,37℃厌氧培养24h平板法计数,计算活菌率。
取菌液50μL接种于5%MS糖的培养基中,每组3个重复,37℃培养24h后分别置于40、60、80℃水浴,处理10、20、30分钟后取样,稀释,涂布在MRS培养基平板培养,37℃厌氧培养24h平板法计数,计算活菌率。